传代细胞培养的实验步骤及注意事项

　　1、严格无菌：

　　传代培养时要注意严格的无菌操作，并防止细胞之间的交叉污染。

　　2、适度消化：

　　消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，酶解消化过程中要不断观察，消化过度会对细胞造成损害，消化不够则难于将细胞解离下来。对于贴壁能力较弱，容易脱壁的细胞，可以不经蛋白酶原消化处理和终止消化这两步，直接对原代培养物或经漂洗后用吸管进行吹打使细胞脱离瓶皿底壁。这种直接吹大的方法对生命力旺盛的细胞如某些肿瘤细胞较为合适。高强度机械吹打易对细胞造成伤害较大，细胞也常有较大数量的丢失，因而绝大部分贴壁生长的细胞需消化后才能吹打，一般不单独采用高强度机械吹打。

　　3、把握好消化液的佳浓度：

　　消化液的消化能力是和溶液的 pH、温度、胰酶浓度及溶液中是否含有 Ca2+, Mg2+和血清等因素有关，实验采用 0.25%胰蛋白酶+0.1%EDTA 的消化液证明可以很好地消化骨髓干细胞。

　　4、吹打细胞动作要轻柔：

　　吹打时用力过猛会损伤细胞。可选择用用大口径的吸管或者管口较大的一次性耗材，减少对细胞的损伤。对贴壁细胞消化后的吹打过程要有序进行，要从一边开始到另一边结束，尤其是器皿的四角处，确保瓶皿底壁各处的细胞都被吹打脱离。

　　5、传代次数不宜过多：

　　传代数是指对培养物传代的次数，它不等于细胞分裂的次数或细胞的代数，而仅代表传代操作的次数。传代对细胞的影响或伤害程度仅次于将活细胞从生物体内取出并进行原代培养的程度。只是因为传代后的细胞生长并不像刚开始原代培养时那样缓慢。每经过一次传代，细胞的生长环境就相应发生一次较大变化。体外生长的细胞若处于动荡的生活环境中，细胞的遗传性往往容易发生改变。经过多次传代培养的细胞，往往容易转化为恶性细胞。因此，传代对细胞生长和性状会产生不利影响，一般情况下要尽可能减少传代次数。