细胞培养是生物医学研究人员必须掌握的一项基本技能,是实验成功与否的关键。所以,了解细胞培养的基本操作要领,对生物医药科研工作者,特别是对基础研究工作者来说,显得尤为重要。文章从实际操作的角度谈谈体外细胞培养操作要点。
一、试验前的准备
一般细胞生长环境为5%的二氧化碳,37℃恒温及饱和湿度。在细胞培养开始之前,实验人员必须查阅资料,了解细胞培养的习惯,如贴壁、半贴壁、悬浮物等。理解细胞生长的营养条件,大多数细胞为10%胎牛血清+89%培养液+1%抗生素。培养基的种类当然很多,高糖、低糖、分化培养基、干细胞培养基等等。
二、细胞消化
与悬浮细胞相比,贴壁细胞的传代步骤较多,应避免不必要的细胞污染。传代操作可以在细胞生长集中程度达到80-90%左右的时候进行。由于细胞生长具有浓度依赖关系,过或过早传代都会影响细胞状态。取细胞培养盒, PBS清洗2次。此时将细胞培养瓶中的液体吸净,可采用真空泵、移液管、一次性吸管等,但无论采用何种吸净方法,均应避免操作手触碰瓶口而造成污染,吸头触碰细胞面而造成细胞机械损伤。将液体吸净,加入适量胰蛋白酶。胰酶不宜过多,只需少量滴在培养瓶上,倾斜培养可使细胞面覆盖。细胞可以在这个时候放置在培养箱里,37℃条件下有利于胰蛋白酶的消化。大约2分钟就可以消化了。自然地,有些细胞更容易消化,可能消化过程只需要30秒,如TC-1、MC-38等肿瘤细胞株;另一些则消化得更慢,如培养的间充质干细胞(MSCs)。
三、接种
对上述细胞沉淀物进行重悬。可借助于旋涡震荡仪进行重悬,也可在重悬细胞前用手指轻弹离心管底部,再加入适量的培养基重悬,切忌直接加入培养基后用移液枪吹干。在2-3个培养瓶中,将重悬好的细胞全部分离,补全生长培养液继续培养。约8-10毫升的培养液用于T25培养,20-25毫升的培养液用于T75培养。注射后,十字混匀,每日镜下观察细胞状况。
细胞培养是生物医学研究人员必须掌握的一项基本技能,是实验成功与否的关键。所以,了解细胞培养的基本操作要领,对生物医药科研工作者,特别是对基础研究工作者来说,...
原代培养及其操作步骤 原代分离细胞培养是指从供体内取出组织后,经机械以及消化分离成单个细胞或单一型细胞群,使之在体外模拟人体生理环境,在无菌、适当温度...