观察细胞的生长状态、更换培养基、细胞传代、细胞计数是细胞系培养的4个常规实验操作。

　　一、细胞传代的原理

　　细胞传代就是对特定条件的细胞一分为二或者更多然后继续培养。

　　一旦细胞开始培养，就会不断消耗营养成分，因此就要定期更换培养基，以实现营养的补充。

　　如果细胞出现增殖，培养空间不能再满足更多细胞生长时，还需要对细胞进行传代培养。

　　对于贴壁生长的细胞，传代意味着需要解离细胞之间的连接，让细胞脱离培养瓶表面，然后再按照需要的比例分去新的培养瓶内；

　　对于悬浮培养的细胞，则只需要吹散细胞后，再分去不同培养瓶就可以完成传代。

　　二、细胞传代的时机

　　细胞在培养瓶内的生长大致会经过3个阶段：延迟期、指数增长期、平台期。

　　只有当细胞处于指数增长期时，才适合进行细胞传代。

　　判断标准：

　　a. 细胞密度

　　正常细胞生长至彼此汇合时，也就是细胞和细胞的边缘开始接触时，就需要传代了

　　b. 培养基营养成分耗尽

　　一般情况下，培养基颜色变黄、pH下降，同时伴随细胞密度较之前的增加，就是传代的信号；而培养基营养耗尽，不一定需要传代，如果细胞密度没有增加，则只需要更换培养液就可以了

　　c. 距离上次传代的时间

　　如果我们每一次都严格按照指定的时间节点，和保持一致的细胞浓度去传代，那么传代时机就可以按照固定的时间点来执行

　　总之，传代的时机需要把握好，太早没必要，太迟则会造成细胞衰退，状态下降，一旦状态下隆甚至出现退化，想要重新恢复就会很困难。

　　把握好细胞传代接种的浓度，尽量调整到4天换液、7天传代，是一个比较理想的状态三、细胞传代的操作以贴壁细胞的消化操作方法为例——

　　1、准备工作

　　A. 清洁台面，紫外消毒

　　确保操作空间没有杂物和污染物

　　B. 准备好实验所需要试剂、耗材

　　【试剂】

　　完全培养基、PBS、胰蛋白酶

　　【耗材】

　　已灭菌处理的离心管、ep管、吸管、吸头

　　C. 准备细胞

　　显微镜下观察确认生长状态良好，且没有微生物污染

　　2、清洗细胞

　　2.1 在超净台内打开瓶盖，使用吸管把培养基吸出并扔弃

　　2.2 吸8-10 mL PBS，沿着细胞生长的对侧面排出，然后平放培养瓶，轻晃数次（ 目的是为了清洗残留的培养基，避免培养基内的血清干扰胰蛋白酶消化，然后再次扔弃PBS ）

      3、消化细胞

　　3.1 向培养瓶加入固定体积的0.25%胰蛋白酶，建议体积为7-10mL

　　3.2 平放培养瓶，让胰酶完全覆盖细胞层，轻晃数次，室温静置15-30秒

　　3.3 然后倾斜培养瓶，使用吸管吸走大部分的胰蛋白酶，只保留几滴

　　3.4 将培养瓶放在37度培养箱内孵育10-15分钟。中间可以拿出培养瓶在显微镜下，观察细胞是否已经变圆，如果细胞变圆隆起，就可以停止消化，反之就延长时间

　　3.5 加入10mL完全培养基，中止消化反应，并使用吸管上下吹打细胞数次，吹打过程注意不要产生气泡（吹打的目的在于让细胞分散成单细胞悬浮状态）

　　4、分瓶培养

　　强烈建议要对消化后的细胞悬液进行细胞计数，并调整细胞浓度后再分瓶培养，而不是按照等体积均分，再补培养基。

　　虽然后者的操作简单很多，但为了保持规律的细胞传代培养，我们应该尽量保持每次传代的细胞浓度一致，这样可以让我们形成规律的传代节奏。    这里的难点在于细胞计数和浓度调整