细胞培养操作

1、复苏细胞
以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主

将冻存管在37℃水浴锅中迅速完全融化(保持冻存管的盖子在液面以上以防止污染)，将完全融化的细胞直接离心，或者转移至无菌1.5ml或其它合适无菌离心管中，500g离心2-5min，吸除上清，注意不要吸走细胞沉淀，然后用新鲜完全培养液重悬后转移至培养器皿，混匀，置于CO2培养箱37℃培养。 第二天视贴壁或生长状态，更换培养液。

2、细胞传代：如果细胞密度达 80%-90%，即可进行传代培养。

a、以10cm细胞培养皿为例。吸出原培养皿中的培养液，用2-5ml无菌PBS润洗细胞1-2次以去除残留的血清(如果细胞贴壁较差，润洗时要轻柔以避免细胞飘起)，然后加1-2ml胰酶细胞消化液(含EDTA)室温消化，注意消化时间，通常为1-5分钟。如果细胞比较难消化，可以置于37℃细胞培养箱一定时间以加速消化。注意：消化时间过长，会导致传代后细胞出现生长状态不良的情况。

b、每30秒-1分钟用显微镜观察细胞消化情况，贴壁细胞明显收缩、细胞间间隙变大、细胞趋于圆形但还未漂起，并用移液器吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打下来时，吸除胰酶细胞消化液，再加入1-2ml新鲜完全培养液，适当晃动细胞皿以终止胰酶作用，用移液器轻轻吹打贴壁的细胞，获取细胞悬液。吹打时需控制力度，避免产生大量气泡，将细胞悬液分别接种到另外的2~5个细胞培养皿内，加入新鲜培养液，置于CO2培养箱37℃培养，第2天观察细胞贴壁生长情况。

c、也可以在消化后，加3-5ml完全培养液终止消化，用移液器轻轻吹打细胞悬液，尽量把细胞全部吹落、吹散，然后将全部细胞悬液500g离心2-5min，离心后去上清，再用完全培养液重悬后转移到新的培养皿中，添加适量完全培养液，于CO2培养箱37℃培养。

d、注意培养液的酚红颜色变化或根据细胞的换液要求定期换液，待细胞密度达到80-90%时需要传代或者冻存。如果没有及时传代导致细胞过密，传代后细胞容易出现生长状态不良的。

3、细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面 T25 瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×10⁶~1×10⁷/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

培养注意事项

1、收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。

2、仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等，确保细胞培养条件一致，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担。

3、用 75%酒精擦拭细胞瓶表面，显微镜下观察细胞状态。因运输问题，部分细胞由于温度变化及剧烈碰撞死亡破碎形成碎片，是正常现象。观察好细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁将 T25 瓶置于 37℃培养箱放置 2-4h。

4、贴壁细胞可以消化，悬浮细胞直接混匀收集细胞，900 rpm-1000 rpm 离心 3 min，弃上清。加 5 mL PBS 重悬细胞，再 900 rpm-1000 rpm 离心 3 min，用新鲜的完全培养基重悬 细胞，并接种到新的培养瓶或培养皿中，置于培养箱中进行培养。

5、请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。

6、建议客户收到细胞后前 3 天各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通 交流。由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和我们联系，告知细胞 的具体情况，以便我们的技术人员跟踪回访直至问题解决。

7、该细胞仅供科研使用。

8、备 注：运输用的培养基 (灌液培养基) 不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培 养条件新配制的完全培养基来培养细胞。收到细胞后第一次传代建议 1:2 传代 。

9、注 意：1 : 2 传代就是 1 个 T25 瓶传 2 个 T25 瓶或者 2 个 6cm 皿。不是 1 个 T25 瓶传 2 个10cm 皿。