MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒

细胞简介

MTT法细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒被广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的检测。活细胞的线粒体中存在与 NADP相关的脱氢酶，可将黄色的MTT还原生成结晶状的蓝紫色的Formazan，死细胞无此酶，MTT不被还原。在特定溶剂存在的情况下，Formazan可以被完全溶解。然后通过酶标仪可以测定460-630nm波长附近的吸光度。细胞增殖越多越快，则吸光度越高;细胞毒性越大，则吸光度越低。

本试剂盒灵敏度高，线性范围宽，使用方便。

试剂盒组成

储存条件

-20°C避光保存

有效期

一年

检测方法

酶标仪

样本类型

动物细胞

试剂盒以外自备试剂和仪器

仪器准备

1、带有450mm滤光片的酶标仪

2、CO2培养箱

试剂准备

1、移液器及吸头。

2、96孔培养板。

使用方法

贴壁细胞

1、收集对数期细胞，每孔加入100ul细胞悬液,使待测细胞调密度约2000-10000孔

2、5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96 孔平底板),加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，也可两小时，或半天时间后加药，一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔。

3、5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。

4、每孔加入10ulMTT溶液，继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS 冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。

5、终止培养，小心吸去孔内培养液。

6、每孔加入150ul溶解液，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶标仪490nm或550nm或570nm 处测量各孔的吸光值。

7、同时设置调零孔（培养基、MTT、溶解液)，对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、溶解液)。

悬浮细胞

1、收集对数期细胞,调节细胞悬液浓度1×10°/ml,按次序将补足的无血清培养基40ul、需检测药物10ul、细胞悬液50ul (即5×10‘细胞/孔)，共 100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水或PBS填充)。每板设对照（加100ul培养基)。

2、置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察融。

3、每孔加入10 ul MTT溶液，继续培养4 h。

4、离心(1000转x10min)，小心吸掉上清，每孔加入100 ul溶解液，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。490nm或550nm或570nm 处测量各孔的吸光值。

5、同时设置调零孔(培养基、MTT、溶解液)，对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、溶解液)，每组设定3-5复孔。

结果分析

1、细胞的存活率:将各测试孔的OD值减去调零孔OD值或对照孔OD值。各重复孔的OD值取均数士SD。

2、细胞的存活率以T/C%表示，T为加药细胞的OD值，C为对照细胞的OD值。

3、细胞存活率%=（加药细胞OD/对照细胞OD)×100。

注意事项

1、避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。

2、细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。

3、还原的MTT在460-630均有较好的吸收，如果你的酶标仪是滤光片，可以选 470 nm左右或630 nm左右的滤光片，如果酶标仪有单波长，你可以在检测前扫描一下吸收谱，选用最大吸收波长检测，最大波长，在550nm 附近，必要时加一个参比波长以扣除非特异性吸收。

4、MTT溶液为黄色，需避光保存，长时间光照会导致失效。当颜色变为灰绿色时，请勿使用。

5、MTT溶液在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固，可以20-25℃水浴温育片刻至全部融解后使用。

6、Formazan溶解液结冻或产生沉淀时可以37℃水浴孵育以促进溶解，并且必须在全部溶解并混匀后使用。